小核試験(in vivo)の目的
小核試験(in vivo)は、化学物質が生体内で染色体異常を引き起こす性質(染色体異常誘発性)を有するかどうかを評価するために行われるin vivo遺伝毒性試験の1つで、医薬品、医療機器、食品、化学物質、医薬部外品など、多岐にわたる製品に対して実施されます。
小核試験(in vivo)の陽性結果は、化学物質が生体内で染色体異常誘発性を有することを示唆します。
小核試験(in vivo)は、医薬品など一部の生物学的安全性評価では、細菌や培養細胞を用いるin vitro遺伝毒性試験と組み合わせて標準的に実施されますが、それ以外の生物学的安全性評価においては、in vitro試験で陽性あるいは陽性が疑われる結果が得られた際のフォローアップとして実施されます。
小核試験(in vivo)の概要
小核とは、細胞分裂や脱核の過程で取り残された染色体やその断片を含む小さな核で、細胞質中に独立して存在します。
化学物質の曝露によって小核を有する細胞の出現頻度が増加する場合、その化学物質は染色体異常誘発性を有すると評価されます。
小核試験は、染色体の構造に変化をもたらす化学物質だけでなく、染色体の数に変化をもたらす化学物質も検出することが出来ます。
マウスあるいはラットに化学物質または医療機器からの抽出液を単回あるいは複数回投与した後、所定のタイミングで評価対象とする細胞(通常、骨髄細胞あるいは抹梢血)を採取します。
採取した細胞から作成したスライド標本を染色した後、蛍光顕微鏡などを用いて標本観察を行います。「小核」を有する幼若赤血球(骨髄の場合)や網状赤血球(抹梢血の場合)の出現頻度を指標とし、陰性対照群と被験物質投与群との間で比較することによって染色体異常誘発性の有無を評価します。
小核試験(in vivo)については、皮膚(表皮)、肝臓、消化管など骨髄細胞あるいは抹梢血以外の細胞を用いる試験法も開発されており、これら試験法は生体内における染色体異常誘発性の作用機序を詳細に調べるうえで有用とされています。
試験方法
小核試験(in vivo)は、染色体切断によって生じた染色体断片(構造異常由来)や細胞分裂異常により取り残された染色体(異数性由来) を小核として検出しますので、基本的には細胞分裂が盛んな組織が試験の対象となります。
臨床適用箇所が皮膚となる薬剤または医療機器など、局所曝露の影響を調べる必要がある場合には、皮膚(表皮細胞)を対象とする皮膚小核試験を実施することも可能です。
また、化学物質および太陽光による複合曝露の影響を生体内で調べる場合には、光皮膚小核試験を実施することも可能です。医療機器の安全性評価では通常、骨髄や末梢血を対象として小核試験(in vivo)を実施します。
骨髄や末梢血を対象とした小核試験(in vivo)では、試験の実施を制限／中止するような毒性が認められない最大投与量(最大耐量) を調べる毒性予備試験を最初に行います。文献や利用可能な他試験の結果などから最大耐量に関する情報が得られる場合は、毒性予備試験を省略します。
その後、毒性予備試験の結果などに基づいて決定した性(毒性に明らかな性差が無い場合は雄性)および投与群［通常、高用量群(最大耐量)、中用量群(高用量の1/2)および低用量群(高用量の1/4) の3用量群］を用いて小核本試験を行います。小核本試験では、各個体から骨髄あるいは末梢血を得てスライドグラス標本を作製します。
小核を有する細胞
骨髄塗抹標本の作製法
判定方法および基準
スライドグラス標本はアクリジンオレンジで染色したのち蛍光顕微鏡下で観察し、小核を有する幼若赤血球数を計測して被験物質の骨髄細胞における小核出現頻度を調べます。また、全赤血球中に占める幼若赤血球の比率も同時に計測し、被験物質の骨髄細胞に対する増殖抑制の有無を調べます。